Los guionistas Robert Ben Garant y Thomas Lennon confirmaron que estaban escribiendo una secuela de Night at the Museum, a la que originalmente se le dio el título tentativo 'Another Night at the Museum'.

La película fue grabada principalmente en Vancouver y Montreal, con escenas adicionales filmadas dentro de la real Smithsonian Institution en Washington, D.C.

Una escena fue grabada en el Lincoln Memorial la noche del 21 de mayo de 2008, y escenas también fueron filmadas en el American Museum of Natural History en Nueva York los días 18 y 20 de agosto de 2008.

Los cineastas prestaron a la Smithsonian Institution los accesorios utilizados en la película, incluyendo la pila de artefactos presentada en la película, que fueron exhibidos en el Smithsonian Castle junto a un folleto que guía a los visitantes hacia los artefactos reales que inspiraron la película.

Las tiendas de regalos de la Smithsonian vendieron una réplica de la bobblehead de Einstein, un accesorio creado específicamente como promoción de la película.

Varios actores aparecen en papeles dobles u ocultos: Amy Adams también interpreta a Tess al final de la película, Robin Williams también da voz a un busto de bronce de Theodore Roosevelt, y Jonah Hill y Ed Helms hacen apariciones sin acreditar como, respectivamente, un guardia de seguridad de la Smithsonian y el asistente de Larry.

Los guionistas Thomas Lennon y Robert Ben Garant ellos mismos interpretaron a los hermanos Wright, Orville y Wilbur, en la película.

Un final alternativo incluido en los lanzamientos de DVD y Blu-ray trae de vuelta a Dick Van Dyke como Cecil Fredericks, Bill Cobbs como Reginald, y Mickey Rooney como Gus de la primera película.