Le développement d'un film G.I. Joe a commencé en 2003, mais quand la guerre d'Irak a éclaté, le producteur Don Murphy a jugé le sujet lié à la guerre inapproprié et a choisi de développer Transformers à la place.

Les premières versions des scripts fuites en ligne ont attiré de fortes critiques de la part des fans, notamment une version où Cobra était complètement abandonnée au profit d'un agent de la CIA corrompu comme méchant et Snake Eyes était rendu muet après que ses cordes vocales aient été tranchées ; ce contrecoup a conduit Stuart Beattie à réécrire le scénario et à l'embauche de Larry Hama, scénariste de bandes dessinées G.I. Joe, en tant que consultant créatif pour le rapprocher des comics.

Le scénariste Skip Woods a ajouté un personnage nommé Alex Mann de la ligne de jouets Action Man britannique, le producteur Lorenzo di Bonaventura plaisantant que les sensibilités politiques autour de la guerre d'Irak rendaient plus facile l'ajout d'un nouveau personnage que de s'engager pleinement sur le nom G.I. Joe.

Channing Tatum a refusé le rôle de Duke sept fois avant finalement d'accepter, en partie parce qu'il sentait que le film glorifiait la guerre après avoir joué dans le film anti-guerre Stop-Loss, mais l'a finalement accepté en raison d'une obligation contractuelle de trois films avec Paramount suite à Coach Carter.

L'acteur irlandais David Murray était à l'origine prévu pour jouer Destro mais a dû se retirer en raison de problèmes de visa de voyage ; il a été ensuite casté à la place comme ancêtre de James McCullen dans une scène de flashback.

Le masque de Cobra Commander de Joseph Gordon-Levitt a été redessiné par rapport à la version des comics parce que l'équipe trouvait que le design original était trop reminiscent du Ku Klux Klan.

Rachel Nichols s'était déjà teint les cheveux en rouge pour son rôle dans Star Trek avant de jouer la rousse Scarlett dans ce film, et elle s'est brûlée en tournant une séquence d'action avec Sienna Miller.

Pour la scène de destruction de la tour Eiffel, Digital Domain a obtenu l'accès aux plans de construction originaux de la tour et a construit un modèle numérique tellement complexe qu'il ne pouvait pas tenir dans un seul fichier informatique.

Quand le canon à impulsion tire sur le sous-marin pendant l'assaut polaire, l'effet sonore utilisé est un son de dé-résolution de programme repris du film TRON de 1982.

En tournant à la Vieille Ville de Prague le 26 avril, plusieurs personnes ont été blessées quand un bus et des voitures ont percuté un véhicule à quatre roues motrices qui semblait avoir des problèmes de freinage.

Sienna Miller a remporté le Golden Raspberry Award pour la pire actrice dans un second rôle, et lors d'entretiens ultérieurs, elle a exprimé ses regrets sur le rôle, en disant qu'elle n'était pas assez imposante physiquement pour jouer un méchant dans une adaptation de bandes dessinées.