Avant qu'Amy Adams n'obtienne le rôle d'Amelia Earhart, Reese Witherspoon était pressentie pour incarner la célèbre aviatrice.

Amy Adams, qui incarne l'aviatrice Amelia Earhart, a en réalité peur de voler.

Les scénaristes du film, Thomas Lennon et Robert Ben Garant, font une apparition à l'écran dans les rôles des frères Wright, Wilbur et Orville.

Plusieurs acteurs apparaissent sans être crédités au générique, comme Ed Helms dans le rôle d'un collègue de Larry et Jonah Hill dans celui de Brandon, un gardien du Smithsonian.

Le film a été tourné principalement à Vancouver et à Montréal, avec quelques scènes filmées à l'intérieur même de la Smithsonian Institution à Washington D.C.

Une scène a été tournée de nuit au Lincoln Memorial le 21 mai 2008, et d'autres scènes ont été filmées à l'American Museum of Natural History de New York les 18 et 20 août 2008.

Le tournage a débuté le 8 avril 2008 et a duré environ quatre mois.

Clint Howard, qui joue un technicien de contrôle au musée de l'air, fait un clin d'œil au film Apollo 13 réalisé par son frère Ron Howard, dans lequel il interprétait déjà un technicien au CAPCOM.

Les séquences où les personnages plongent dans l'univers de photographies et tableaux rappellent le jeu vidéo Super Mario 64, où le joueur dirige Mario à travers des mondes figurant sur des tableaux traversés.

C'est le second film où apparaissent à la fois Napoléon Ier et Abraham Lincoln, après L'Excellente Aventure de Bill et Ted (1989).

Pour la promotion du film, la Smithsonian Institution a exposé dans son bâtiment (le Smithsonian Castle) des accessoires prêtés par la production, dont la pile d'artefacts visible dans le film, avec des étiquettes portant le logo 'Night at the Museum'.

Les boutiques de cadeaux du Smithsonian ont vendu une réplique de la figurine bobblehead d'Albert Einstein, créée spécialement comme produit dérivé du film.

Le film a connu un démarrage bien inférieur au premier opus au box-office nord-américain (177 millions de dollars contre 250 millions), bien que le total mondial reste proche (413 millions de dollars).

Les scénaristes Robert Ben Garant et Thomas Lennon avaient initialement prévu le titre provisoire 'Another Night at the Museum' pour cette suite.