Avant la publication du roman, l'acteur Gene Hackman détenait les droits du livre et voulait réaliser le film tout en y tenant un rôle, mais il abandonna le projet après avoir jugé le scénario de Ted Tally trop violent, notamment parce que ses enfants souhaitaient qu'il arrête les films violents.
Les droits du personnage d'Hannibal Lecter appartenaient au producteur Dino De Laurentiis suite à Manhunter (1986) ; en raison de l'échec commercial de ce film, il les a prêtés gratuitement à Orion Pictures pour Le Silence des agneaux.
Amblin Entertainment a refusé le projet, jugeant qu'il ne correspondait pas au style de Steven Spielberg, avant que Jonathan Demme ne soit choisi comme réalisateur alors que le scénario n'était pas encore terminé.
Avant Jodie Foster, Demme avait proposé le rôle de Clarice Starling à Michelle Pfeiffer, qui refusa car mal à l'aise avec la noirceur du sujet ; Meg Ryan, Kim Basinger et Emma Thompson furent aussi approchées ou envisagées, et Molly Ringwald auditionna mais fut jugée trop jeune.
Pour le rôle d'Hannibal Lecter, la production envisagea d'abord Robert Duvall puis Sean Connery, qui refusèrent tous deux jugeant le scénario immoral ou trop sombre, avant qu'Anthony Hopkins n'obtienne le rôle grâce à sa prestation dans Elephant Man (1980).
Quand l'agent d'Anthony Hopkins lui annonça l'envoi d'un scénario intitulé The Silence of the Lambs, l'acteur demanda en plaisantant s'il s'agissait d'une histoire pour enfants, avant de changer d'avis après avoir lu les dix premières pages, qu'il jugea être le meilleur rôle qu'il ait jamais lu.
Anthony Hopkins s'est inspiré de l'ordinateur HAL 9000 de 2001, l'Odyssée de l'espace ainsi que des intonations de l'écrivain Truman Capote pour construire sa voix et son jeu figé et sans clignement des yeux, contrairement à des rumeurs l'associant à Katharine Hepburn ou Charles Manson.
Scott Glenn, pour préparer son rôle de Jack Crawford, rencontra l'agent du FBI John E. Douglas qui lui fit visiter Quantico et lui fit écouter un enregistrement sonore réel de tortures commises par les tueurs en série Lawrence Bittaker et Roy Norris, ce qui le fit pleurer et modifia sa position sur la peine de mort.
Le tournage s'est déroulé du 15 novembre 1989 au 1er mars 1990, principalement à Pittsburgh et ses environs en Pennsylvanie, ainsi qu'aux Bahamas pour la scène finale.
Le FBI a exceptionnellement autorisé le tournage de scènes dans les véritables locaux de l'Académie du FBI à Quantico, certains membres du personnel du FBI apparaissant même dans de petits rôles.
Une scène censée se dérouler dans le bureau du directeur du FBI a en réalité été tournée dans le vrai bureau de la secrétaire américaine au Travail Elizabeth Dole, à Washington.
La conception du sous-sol et du puits utilisés par Buffalo Bill s'inspire des enlèvements et meurtres réels commis par Gary Heidnik.
Le roman de Thomas Harris, et donc le film, s'inspire de plusieurs tueurs en série réels : Ted Bundy (qui simulait un bras cassé pour attirer ses victimes), Gary Heidnik (qui séquestrait des femmes dans une cave) et Ed Gein (qui portait la peau de ses victimes et se contemplait dans des miroirs, inspiration également de Norman Bates dans Psychose et de Leatherface dans Massacre à la tronçonneuse).
Le masque emblématique porté par Hannibal Lecter a été conçu par Ed Cubberly, un fabricant de masques pour gardiens de but de hockey sur glace du New Jersey.
Plusieurs éléments diffèrent du roman original : dans le livre Lecter s'évade grâce à une clé fabriquée à partir d'un ressort de sa couchette, alors que dans le film il utilise l'agrafe métallique d'un stylo oublié par le docteur Chilton ; de plus, dans le roman Lecter possède six doigts à la main gauche, détail absent du film.
La partition orchestrale de Howard Shore a été enregistrée à Munich durant l'été 1990 avec l'Orchestre symphonique de Munich ; le compositeur a voulu une musique discrète qui « s'intègre dans le tissu du film » sans que le spectateur en soit conscient.
La chanson 'Goodbye Horses' de Q Lazzarus, utilisée dans la scène culte où Buffalo Bill se maquille et danse devant un miroir, est devenue un succès culte grâce à cette apparition dans le film.
Le Silence des agneaux est le seul film d'horreur à avoir remporté l'Oscar du meilleur film, et seulement le troisième film de l'histoire (après New York-Miami et Vol au-dessus d'un nid de coucou) à remporter les cinq récompenses majeures aux Oscars : meilleur film, meilleur réalisateur, meilleur acteur, meilleure actrice et meilleur scénario adapté.
Lors de sa ressortie au Royaume-Uni en 2017, le British Board of Film Classification a reclassé le film d'une interdiction aux moins de 18 ans à une interdiction aux moins de 15 ans, un des producteurs estimant que le public s'était désensibilisé depuis sa sortie initiale.
Lors de sa campagne présidentielle de 2024, Donald Trump a fait référence à plusieurs reprises à Hannibal Lecter en le décrivant comme 'un homme merveilleux' et en comparant des immigrants au personnage, ce qui a poussé Anthony Hopkins à se dire 'choqué et consterné'.
