L'idée de la série est née après que l'épouse d'Anthony Zuiker lui a parlé d'un documentaire, The New Detectives, diffusé sur Discovery Channel et montrant les méthodes des détectives légaux comme l'utilisation de l'ADN. Zuiker a ensuite suivi de vrais enquêteurs du LVMPD (police de Las Vegas) avant de développer le concept avec Jerry Bruckheimer.

Le projet a d'abord été présenté aux dirigeants d'ABC, NBC et Fox, qui l'ont refusé, avant que CBS ne l'accepte et ne l'intègre immédiatement à sa grille de 2000.

Touchstone Television, qui devait coproduire la série avec CBS, s'est retirée du projet car sa maison mère Disney ne voulait pas financer une émission diffusée sur une chaîne concurrente (ABC appartenant aussi à Disney). Le groupe canadien Alliance Atlantis est alors intervenu comme coproducteur pour sauver le projet.

William Petersen avait un contrat 'pay-or-play' avec CBS et souhaitait jouer dans le pilote de CSI, ce qui a facilité l'acceptation du projet par la chaîne.

La série a d'abord été tournée à Rye Canyon, un campus appartenant à Lockheed Martin situé à Valencia (Santa Clarita, Californie), choisi pour sa ressemblance avec les environs de Las Vegas, avant de déménager aux studios de Santa Clarita après l'épisode 'The 1-15 Murders'.

Après la saison 5, le tournage s'est principalement déroulé aux Universal Studios Hollywood, tout en conservant certaines scènes extérieures à Santa Clarita en raison de la polyvalence du décor.

Certaines scènes ont été tournées directement à Las Vegas, comme l'épisode 'Suckers' de la saison 4, filmé en décembre 2003 dans un club gothique loué sur place, avec des scènes supplémentaires tournées en janvier 2004 au Caesars Palace.

Le générique de la série est 'Who Are You' de The Who, interprété par Roger Daltrey ; celui-ci a fait une apparition spéciale dans l'épisode 'Living Legend' (saison 7) sous les traits du personnage Mickey Dunn, épisode truffé de clins d'œil musicaux comme les mots 'who's next' inscrits sur un tableau blanc.

De nombreux artistes ont interprété leur musique à l'écran dans la série, dont Ozzy Osbourne, The Wallflowers, John Mayer et Akon, tandis que des groupes comme Rammstein et Linkin Park ont été utilisés massivement dans l'arc narratif du personnage Lady Heather.

En 2007, une campagne de fans nommée 'Your Tax Dollars at Work' a été organisée pour empêcher le départ de Jorja Fox (Sara Sidle) de la série, récoltant plus de 8 000 dollars pour des cadeaux et actions envoyées aux producteurs, dont un gâteau de mariage et 192 insectes enrobés de chocolat avec le message 'CSI Without Sara Bugs Us'.

En 2007, une maquette miniature du bureau de Gil Grissom, construite par le personnage pendant la saison 7, a été vendue aux enchères sur eBay pour 15 600 dollars, somme reversée par CBS à une association caritative.

La série a été critiquée par des professionnels de la police scientifique pour son manque de réalisme, notamment le fait que les techniciens de scène de crime y mènent aussi des raids, des interrogatoires et des arrestations, tâches normalement réservées aux détectives dans la réalité.

Le succès de la série a donné naissance au phénomène dit du 'CSI effect', selon lequel les jurés et victimes de crimes réels développeraient des attentes irréalistes envers la police scientifique, influençant la présentation des preuves lors de vrais procès.