Le projet de série a démarré grâce à l'agent de licence Mark Freedman, qui a découvert la bande dessinée en 1986 et a convaincu le fabricant de jouets Playmates Toys de s'y intéresser ; celui-ci a toutefois exigé qu'un accord télévisé soit signé avant de lancer une gamme de figurines.

La première mini-série en cinq épisodes a été diffusée fin décembre 1987, et ce n'est qu'après ce lancement que Playmates Toys a sorti sa première ligne de figurines Ninja Turtles à l'été 1988.

Le budget des cinq premiers épisodes s'élevait à près de 2 millions de dollars, et l'animation des trois premières saisons a été confiée au studio japonais Toei Animation, coproducteur de ces saisons ; certains épisodes ont aussi été produits dans le studio satellite de Murakami-Wolf-Swenson à Dublin, en Irlande.

David Wise et Patti Howeth ont écrit le scénario de la mini-série pilote en cinq parties ; Wise a ensuite écrit plus de soixante-dix épisodes de la série avant de quitter le programme au cours de la neuvième saison, remplacé par Jeffrey Scott.

Selon Renae Jacobs, voix d'April O'Neil, toute la distribution principale enregistrait ses dialogues ensemble en studio à Los Angeles, ce qui favorisait la camaraderie et beaucoup d'improvisation entre les acteurs.

D'après Renae Jacobs, les acteurs contrecarraient souvent volontairement les intentions des créateurs de rendre la série plus sombre et sérieuse, en privilégiant un ton plus léger et comique.

Lors du crossover cinématographique Turtles Forever en 2009, aucun des doubleurs originaux n'a pu reprendre son rôle pour des raisons budgétaires, obligeant à recourir à des acteurs de remplacement.

Pour la resurgence de Shredder lors du crossover avec la série de 2012, c'est Kevin Michael Richardson (voix du Shredder de cette version) qui a doublé le personnage, James Avery, voix originale, étant décédé en 2013.

À partir de la huitième saison, dite 'Red Sky', le ciel de chaque épisode a été teinté d'un rouge sombre permanent, le générique a intégré des extraits du premier film live-action, et le ton est devenu nettement plus sombre et orienté action, en écho aux comics originaux plus sombres.